肝细胞癌(HCC) 大约占所有原发性肝癌类型的90%以上，同时也是全球癌症相关死亡的第三大癌种。70%~80%的肝癌患者早期临床症状不明显，加上肝癌早期筛查的不足，一些患者确诊时已是晚期而错失最佳的手术机会[1]。尽管肝动脉化疗栓塞手术、索拉非尼等分子靶向药物、以及PD-1/PD-L1抗体等免疫检查点抑制剂能够一定程度延缓肿瘤进展，延长患者生存时间，但其效果仍然有限。另外，临床试验的数据显示，单独使用PD-1单抗治疗肝癌患者并不能显著改善病情，而且免疫靶向的药物在治疗肝癌伴有非酒精性脂肪性肝炎患者时，效果会明显下降，这一方面是由于原发性或获得性抗PD-1抵抗导致，另一方面与肿瘤微环境中免疫细胞功能改变有关[2-4]。

肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAM)是存在于各类肿瘤微环境中的一群巨噬细胞，主要维持慢性炎症及免疫耐受微环境并且促进肿瘤生长[5]，可因微环境的改变而发生功能改变。TAM作为肝癌肿瘤微环境中的重要组分，在肿瘤免疫逃避中发挥着不可或缺的作用，并且与获得性抗PD-1治疗抵抗有关。本文总结TAM在肝癌发生发展过程中的作用，并对TAM对肝癌免疫微环境的影响以及最新的靶向TAM的治疗手段进行综述，为肝癌免疫治疗发展提供一些新思路。

1.肝内正常的巨噬细胞

肝脏是人体最大的实体器官，同时也是免疫豁免器官，是人体中组织驻留巨噬细胞含量最丰富的器官之一。肝内巨噬细胞在肝脏免疫豁免中发挥关键作用。正常情况下，肝脏巨噬细胞大体分为两群，一群是定居于肝内并能增殖和自我更新，主要来源于胎儿肝脏中卵黄囊衍生的红细胞髓系祖细胞, 即常说的Kupffer细胞，约占肝内总巨噬细胞数的80%左右；另一群是来自循环的单核细胞，这些单核细胞是由骨髓定居的造血干细胞分化而来，经过血液循环到达肝脏。在非疾病状态下，这些巨噬细胞可以分泌IL-10和PD-L1分子促进肝脏形成免疫耐受状态而维持内环境稳定。肝内巨噬细胞可分化成促炎性的M1型和抗炎的M2型巨噬细胞，两种类型的巨噬细胞所分泌的效应因子有差异，发挥的功能也不同，在肝脏微环境中，两种类型的巨噬细胞的比例保持着微妙的平衡，共同维持肝脏内环境的稳定。在炎症性疾病的早期阶段，Kupffer细胞招募中性粒细胞和外周单核细胞进入肝脏损伤部位，促进炎症发展和纤维溶解，这一阶段M1型巨噬细胞占据主导地位；随着疾病进展，巨噬细胞转为M2型，发挥免疫抑制和纤维形成作用，炎症也逐渐由急性转为慢性[6]。

2.肿瘤相关巨噬细胞(TAM)

TAM是一群浸润或邻近肿瘤组织的巨噬细胞，在肿瘤免疫微环境中含量丰富，可占到实体瘤免疫细胞群体的50%以上。多数报道认为，存在于肿瘤微环境的巨噬细胞就属于TAM, 因此肝癌中的TAM来源除了骨髓来源的单核细胞，还有一部分的Kupffer细胞。早期研究认为Kupffer细胞在肝癌免疫微环境中的作用仅仅是参与抗肿瘤免疫，但后期也有研究证据显示Kupffer细胞是TAM群体的一部分并且促进肿瘤进展[7]。对肝癌组织进行免疫荧光染色发现，TAM主要聚集在癌组织周围而非癌中心位置，并且其糖酵解水平增高[8]。TAM可通过直接吞噬作用或分泌细胞因子等方式发挥调节功能。TAM可根据具体的功能可分M1样和M2样细胞，这两种不同的极化状态分泌的效应因子不同。M1样TAM主要产生一型的促进炎症的细胞因子，如IL-1β、IL-1α、IL-12、TNF-α和GFAP, 起着促进适应性免疫和抗肿瘤作用。而M2样TAM主要分泌二型细胞因子，如TGF-β、IL-10、CCL17等，并且PD-L1表达水平升高, 发挥着抗炎作用从而促进肿瘤的发展[9-10]。一般认为，在肿瘤发生的初期，TAM能够识别并清除肿瘤细胞，抑制肿瘤的形成；但随着肿瘤的发展，TAM对肿瘤细胞的生长、侵袭和肿瘤免疫逃逸状态的维持起促进作用。

3.TAM在肿瘤中的作用

3.1   TAM促进肝癌内血管形成

肝癌肿瘤为了更好地提供充足的营养给肿瘤细胞，会形成大量的微血管。临床数据[11]显示，肿瘤组织中的微血管密度与TAM的数目呈现相关性，提示TAM可以促进肝癌组织血管生成。进一步研究表明TAM可分泌VEGF-A、EGF、PIGF、TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-8、CCL2、IL-1、IL-6、CXCL8和CXCL12等促血管生成细胞因子，促进肿瘤组织形成血管。另外，TAM还能产生血管生成调节酶如环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)进一步调节肿瘤内微血管的形成[12-15]。低氧环境会诱导血管生成增多，在低氧诱导的血管生成过程中，HIF-1a通路至关重要。同时TAM中的HIF-1a激活也促进血管的生成。巨噬细胞倾向于低氧区域通过HIF-1a途径促进其产生VEGF-A、CCL2、CCL5、IL-8 (CXCL8)、CXCL10、CXCL12和CXCL13等，这些细胞因子可促进肿瘤内血管生成。在肿瘤微环境中，还存在一些表达TIE2的TAM，其与肿瘤内微血管密度存在相关性，通过分泌促血管生成因子影响肿瘤血管再生[16]。除了TIE2+TAM, 以CCR2+为标志的一群TAM在肝癌血管生成中也有促进作用，研究发现CCR2+TAM分布在肿瘤血管丰富的边界区域，通过RNA-seq分析CCR2+TAM发现这一群细胞内促炎与促血管生成的相关信号通路明显增多，并且靶向CCR2+TAM可抑制肝癌血管的形成[17]。肝癌细胞内YAP/TEAD4通路促使CCL2表达增多，招募更多的巨噬细胞，但这群细胞未成熟，且高表达CCR2、Cx3cr1以及促血管生成血小板源性生长因子。这群M0型巨噬细胞与肝癌的血管形成呈相关性并与疾病的不良预后密不可分[18]。这些结果均表明，TAM在肝癌微环境中，对血管形成过程进行调控，促进肿瘤进展，此外，这些研究也表明肝癌微环境中TAM具有异质性，发挥的功能特性在不同的时空位置是不同的。

3.2   TAM促进肝癌侵袭转移

转移灶的出现是肝癌手术切除疗效差的重要因素之一，肝癌侵袭转移的发生与多种机制相关；研究表明TAM能增强肝癌的侵袭和转移能力。临床数据显示，TAM的增多与肿瘤体积、血管侵袭、肿瘤数目和分期呈现正相关，TAM的密度与患者的长期总体生存率和无病生存期负相关[19-20]。TAM对肿瘤侵袭性的调控可通过其调节基质环境的能力实现，巨噬细胞是组织蛋白酶、MMP和丝氨酸蛋白酶的主要来源之一，可有效调节细胞外基质环境。研究发现MMP9+TAM可通过降解细胞外基质促进肝癌细胞的侵袭和转移[21]。除了改变肿瘤组织中细胞外基质和基底膜的组成，TAM还能促进肿瘤细胞发生上皮间充质细胞转变(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，增强肿瘤细胞自身迁移侵袭能力，促进肝癌转移。TAM分泌的IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β、EGF、VEGF、MMP-2和MMP-9均可促进肿瘤细胞发生EMT[22]。另外，TAM来源的CCL22可激活肿瘤细胞内Snail信号，使其发生EMT[23]。另一项研究[24]显示，坏死小体诱导TAM分泌的IL-1β可促进肿瘤细胞发生EMT和转移发生。此外，肿瘤细胞内的HDAC6-let-7i-5p-TSP1通路激活，TSP1蛋白分泌增多，可竞争性结合CD47, 抑制细胞之间的CD47-SIRPα相互作用，从而重新激活“eat me”信号，使得肿瘤转移和血管形成能力下降[25]。这一研究说明，TAM的“eat me”信号在肿瘤转移上发挥抑制作用。综上所述，TAM除了分泌各种基质调节蛋白导致肿瘤外部因素发生改变从而促进肿瘤转移，另一方面，TAM还可通过分泌各种细胞因子或者吞噬作用而调控肿瘤细胞内在因素的改变，促进肿瘤细胞自身侵袭能力的改变，导致肝癌细胞远端转移的发生。

3.3   TAM增强肝癌细胞干细胞特性

肿瘤内有一些未成熟的低分化的细胞，是有自我复制和多细胞分化能力的一类细胞亚群，表现出干细胞特性，称为肿瘤干细胞。在人源肝癌组织中，TAM的数目与肿瘤干细胞的密度呈正相关，并且这种肿瘤干细胞的增多是由TAM分泌的TGF-β导致的，另外还有报道称TNF-α也会导致肿瘤细胞干细胞特性的产生[26-27]。除了分泌细胞因子，TAM也可分泌外泌体和S100钙结合蛋白A9(S100 calcium-binding protein A9)对肿瘤细胞的干细胞特性进行调节[28-29]。有研究[30]报道，CD44+的肿瘤细胞具有干细胞特性，而肿瘤微环境中的巨噬细胞所分泌的IL-6可通过STAT3通路促进CD44+肿瘤细胞增殖和成瘤能力，而使用tocilizumab抑制IL-6R会减少CD44+肿瘤细胞的数目。尽管TAM与肝癌细胞干细胞相关报道并不多，但是现有数据均支持TAM促进肿瘤干细胞特性的产生和维持，导致肿瘤的复发和转移。TAM不仅仅被肿瘤微环境“教育”，TAM也能反过来调节肿瘤细胞的干细胞特性，形成恶性循环，打破这种恶性循环是探索治疗新方案的重点。

3.4   TAM抑制抗肿瘤免疫

肝癌中的肿瘤微环境极其复杂，它由大量的非正常细胞外基质、免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)、肿瘤相关内皮细胞组成[31]。

TAM可通过分泌的细胞因子对免疫微环境中各类T淋巴细胞的功能进行调节，维持肿瘤免疫逃逸状态。巨噬细胞来源的IL-12和IL-10可调控T淋巴细胞的活力和功能，IL-12可促进Th1细胞活化，相反，IL-10主要促进Th2细胞的活化和细胞毒性T淋巴细胞的减少。肿瘤微环境中TAM分泌IL-12减少，而IL-10分泌增多，总体起到免疫抑制的作用[10]。TAM所分泌的前列腺素E2及IL-10可诱导肿瘤微环境中调节性T淋巴细胞的产生，此外，其分泌的趋化因子CCL17、CCL18和CCL22促进调节性T淋巴细胞向肿瘤位置迁移，间接抑制细胞毒性T淋巴细胞的功能[32]。TAM的cGAS-Sting信号通路的激活会导致IRF3活化，Ⅰ型IFN分泌增多，T淋巴细胞和单核细胞浸润增加[33]。同时IFN-α可促进TAM持续表达PD-L1, 从而重塑免疫抑制微环境[34]。除了分泌的各类细胞因子，TAM细胞表面表达的一些蛋白分子也发挥着免疫调节作用。TAM细胞表面高表达PD-L1，与CD8+T淋巴细胞的PD-1受体结合，抑制细胞毒性抗肿瘤免疫效应[35]。此外，高表达于Kupffer细胞上的galectin-9，是一种Tim3的配体，galectin-9/Tim-3信号通路可促进T淋巴细胞的衰老发生，抑制galectin-9/Tim-3信号通路可促进浸润肿瘤的Tim-3+T淋巴细胞增殖和相关效应分子的表达，从而改善肿瘤的免疫抑制环境[36-37]。巨噬细胞作为固有免疫的组成部分，可通过吞噬作用在肿瘤早期发挥抗肿瘤作用，可随着肿瘤细胞表达的CD47增多，与TAM表达SIRPα受体结合，“don’t eat me signal”激活，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬杀伤作用[38]。

免疫抑制酶可通过调节细胞外介质的营养组成和生成调节性代谢物影响T淋巴细胞的免疫反应。TAM可分泌各类免疫抑制酶，如Indoleamine-pyrrole 2, 3，它可抑制细胞毒性T淋巴细胞反应，并可促进调节性T淋巴细胞的迁移、分化和成熟；除此之外，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶以及胞外酶CD39和CD73等均在TAM上有不同程度的表达，并且发挥免疫调节作用[39]。

由此可见，肝癌进展期TAM可通过分泌细胞因子或表达膜分子，通过直接杀伤作用，或者间接调节T淋巴细胞的作用，发挥免疫抑制作用，促进肿瘤进展。尽管肝癌中M1样TAM有一定的促进适应性免疫的作用，但是对于比例更高的M2样TAM，其抗肿瘤效果是微乎其微。M2样TAM在肝癌中的占比高也可以解释单独抗PD-1单抗治疗效果有限的部分原因。

4.TAM相关的抗HCC治疗靶点

肿瘤组织内的巨噬细胞大多为M2型，并且发挥促肿瘤作用，因此减少肿瘤内TAM的数量是一种有效的抗肿瘤治疗策略。研究[40]发现单独使用索拉非尼治疗肝癌虽然可以抑制肿瘤增殖和转移，但伴随着TAM的增多，通过使用负载氯磷酸盐脂质体(clodrolip) 或唑来膦酸(zoledronic acid)清除肿瘤内的巨噬细胞，可增强索拉非尼对小鼠肝癌的增长和血管形成以及转移的治疗作用，两药联合获得了更好的治疗效果。HIF抑制剂32-134D可减少肿瘤组织内TAM和髓系来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)的比例，提高CD8+T淋巴细胞的占比，联合抗PD-1治疗在小鼠Hepa1-6模型上效果显著[41]。含有C6神经酰胺的纳米脂质体可抑制肝脏肿瘤生长，部分原因是通过抑制TAM的数量和M2极化[42]。

CCL2/CCR2轴是单核细胞由外周血液循环向炎症或肿瘤部位迁移的重要信号通路，针对CCL2/CCR2轴的中和抗体和小分子药物以及核酸适配体抑制剂均对肝癌有治疗作用[43]。堪非醇，一种长苞冷杉的天然提取物，是CCR2的拮抗物，可增强索拉非尼对肝癌的治疗作用[44]。此外，研究[45-46]发现CSF1/CSF1R轴招募TAM和MDSC促进肿瘤进展，针对CSF1R的抑制剂BLZ945与抗PD-1单抗联用能有效治疗小鼠原位肝癌。同样地，Gö6976靶向PKCα/ZFP64/CSF1轴与抗PD-1联用效果较单独使用抗PD-1治疗小鼠肝癌模型效果更好。

除了改变肿瘤组织内巨噬细胞的数量，多种药物可通过改变存在于瘤内巨噬细胞的极化状态来发挥抗肿瘤效果。中药黄芩苷可促进M2样TAM向M1样转化，小分子药物BrMC以及针对CSFR的抑制剂均对TAM的极化状态有调节作用[47]。研究表明低剂量的索拉非尼可抑制TAM向M2型转化，促进其向M1型促炎性巨噬细胞分化，并产生更多的IL-12, 增强抗肿瘤免疫反应。另外，17β-雌二醇(17β-estradiol)可通过调节巨噬细胞极化而抑制HCC生长，在机制上主要通过抑制雌激素受体β (ER-β)与ATP5J的相互作用，阻断JAK1-STAT6信号通路，从而促进巨噬细胞向M1极化[48]。蟾毒灵可驱动肝癌内巨噬细胞向M1极化，促进肝癌的抗肿瘤免疫，机制上，蟾毒灵促进p65-p50异质二聚体形成多于p50同二聚体，NF-κB信号通路被激活，从而促进肝癌抗肿瘤免疫[49]。另外，针对CD47的单克隆抗体促进巨噬细胞向肿瘤组织迁移以及对肿瘤细胞的吞噬作用，抑制肝癌进展[50]。

5.总结与展望

综上所述，TAM与肝癌发生发展的整个过程均密切相关，并且在肿瘤中主要以M2样的状态促进肿瘤免疫耐受，导致肝癌恶性进展。TAM既可以通过分泌各类细胞因子等对肿瘤细胞行为进行调节，也可以改变肿瘤细胞所处的微环境而发挥促瘤作用。尽管TAM在肝癌中的作用已有大量报道，但其错综复杂的调控机制仍然有待深入探究，这些调控机制的发现对未来发展新的肝癌治疗靶点有重要的指导意义。以TAM为靶点，针对TAM数目和功能的治疗措施联合常规治疗方式如索拉非尼或抗PD-1等在小鼠肝癌模型中取得了令人鼓舞的成绩，但是目前大部分证据仅局限于动物模型上，如何从基础研究实现临床转化，对于广大科研工作者仍是巨大挑战。相信随着研究深入，围绕TAM的治疗方式一定能取得更大的突破，为肝癌患者带来新的希望。