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感染问题是众多临床医师每天都要面对的问题，当一张临床标本病原微生物培养检验报告单（包括mNGS检测）摆在面前，尤其是真菌检测阳性时，应如何鉴别它的准确性？它的参考价值有多大？是定植还是感染？治疗还是观察？
感染性疾病是个永恒的三角，而真菌感染是一个诊治更加困难的永恒的三角。
2019年欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组（EORTC/MSGERC）新共识延续了2008年分级诊断原则，即确诊、可能诊断及疑似诊断。我国《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则（第六次修订版）》将侵袭性真菌病（IFD）的三级诊断定义为“确诊、临床诊断及拟诊”。但真菌病原学检查仍然是临床诊断和确诊的金标准。
近年来，真菌的微生物诊断方法不断进展。在疑似感染患者中，主要通过临床标本的常规检测（如涂片镜检和培养）、生物标志物检测（如G试验和GM试验）以及分子生物学检查（PCR、mNGS）获得诊断。其中，真菌涂片镜检和培养的敏感性偏低，但仍被业内认为是真菌实验室检查的基石。
感染问题是众多临床医师每天都要面对的问题，当一张临床标本病原微生物培养检验报告单（包括mNGS检测）摆在面前，尤其是真菌检测阳性时，应如何鉴别它的准确性？它的参考价值有多大？是定植还是感染？治疗还是观察？将定植、污染判断为感染，会导致临床过度治疗，增加不良反应发生率，诱导耐药性的产生；而将感染判断为定植、污染，则会延误临床治疗，增加患者的病死率。
鉴别定植、污染与感染的困难较大，尤其是开放系统（包括呼吸系统、泌尿系统、消化道和口腔）标本分离出的病原菌，其中呼吸道标本尤为突出，因为口咽部和鼻咽部为正常菌群的定植部位，痰培养出现病原菌，不能确诊是否为感染，即使采用肺泡灌洗，仍然不能解决这一问题。特别是呼吸道标本中真菌培养阳性的鉴别更为困难，例如呼吸道分泌物包括BALF检测到念珠菌的意义就不大。
2009年IDSA念珠菌病治疗指南指出“呼吸道分泌物念珠菌阳性很少代表感染，不应进行抗真菌治疗”。而2016年IDSA念珠菌病治疗指南指出“呼吸道分泌物念珠菌阳性，通常表示定植，很少需要抗真菌治疗”。相较于2009年指南，2016年指南对分泌物念珠菌阳性的干预推荐不再像以前一样绝对和保守。
临床医生的基本功：正确采集和运送标本
优秀的临床医生应该知道何为最佳标本
组织和无菌体液（血、骨髓、脑脊液、关节液、胸/腹腔穿刺液）标本有很高的诊断价值。
呼吸道标本：BALF＞抽吸分泌物＞诱导痰＞深部痰。
痰临床意义有限，却是临床送检率最高的标本，因此痰标本的可靠性关键在临床，医生必须知道正确留取痰标本的方法。
血培养目前国内的现状是有适应证也不做（意识很差），即使做了，也可能存在检测的套数不足、容量不够、保存与运送不当、实验室没有及时上机等问题。
怎样才算是一份合格的痰标本？
（1）痰标本的采集方法：
医生或护士直视下采集标本，如有必要，可用吸痰器采集。
患者先用无菌生理盐水漱口，去除表面的菌群。
教育患者深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液。
（2）时间要求
清晨的痰含菌量最多，是最佳采集时间，但不应受此限制而导致在应用抗生素之后采集所谓“最佳”的痰标本。
应在抗生素使用前采集痰标本。
标本采集后1~2 h内必须立即进行实验室处理。
如果无痰，可用5 ml 3%~5%的NaCl雾吸约5 min导痰，也可采用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等方法取痰。
不建议24 h之内多次采集，除非痰液外观性状出现改变。
一份合格的痰标本应该是痰涂片镜检每低倍视野＜10个鳞状上皮细胞，＞25个多核白细胞。
不同病原体标本的最佳类型
针对不同病原体，呼吸道标本的类型不同。痰和BALF是所有病原体的最佳标本，但对于病毒，咽拭子亦可。
2017年欧洲指南对于真菌感染气道标本检测的实验室推荐如下。
不同感染获取的标本不同。如果是上呼吸道，真菌多为念珠菌，所以最佳标本为口腔黏膜拭子、舌拭子或口咽拭子。
下呼吸道标本中，痰和支气管镜标本最为重要。
医院获得性肺炎，如果培养曲霉，最好的标本是支气管抽吸物、BALF和防污染样本毛刷（PSB）。
BALF标本培养的阳性率高，合格率高；采集不需要患者的配合；能避免上呼吸道定植菌的污染，减少对培养结果判断的干扰。对于危重患者，下呼吸道标本获取途径主要包括灌洗和刷检，但作为感染疾病的标本操作应规范，可以参考中华医学会呼吸病学分会感染学组专门制定的感染疾病支气管肺泡灌洗操作规范。
检验医生的基本功：正确地检测标本
痰标本在病原学诊断中面临的困难
咳痰：CAP患者40%以上无法或及时产生痰。
痰标本：合格率较低，甚至送检唾液。
培养：痰培养阳性率受多种因素影响且影响极大，包括标本采集、运输、快速处理、合理应用细胞学判断标准、前期有无抗菌药物治疗、解释技能。
涂片革兰染色：最新数据表明，通过革兰染色辨别1669个CAP住院患者合格标本，仅有14%可以辨别出主要形态类型。
涂片结果的规范报告应包括的内容
（1）必备要素：①检测项目；②微生物学检查：阴性、阳性，具体描述，细菌革兰染色（形态、染色、排列、半定量、比例）；③细胞学检查结果。
（2）建议要素和注意事项。
另外，真菌病原体的名称应规范，如“卡氏肺孢子虫”应为“耶氏肺孢子菌”、“马尔尼菲青霉”应为“马尔尼菲篮状菌”、“肠杆菌科细菌”应为“肠杆菌目细菌”、“恙虫病立克次体”应为“恙虫病东方体”、“曲霉菌、毛霉菌”应为“曲霉、毛霉”、“接合菌”（取消），应为“毛霉”，等。
不合格标本：实验室应拒收
实验室应有客观标准判断质量。
临床要理解、支持实验室拒收标本。
只有标本合格，结果才有意义。
痰标本—从检验的角度如何区分定植与感染
最简单和最直接的证据就是痰涂片：①感染菌会导致白细胞大量增加；②感染早期（细菌，真菌）启动非特异性免疫因子；③中性粒细胞是最主要的免疫细胞，吞噬和包裹现象是反映病原菌与机体免疫系统相关性的最重要信号，观察这一现象有助于区分定植和感染。
BALF的涂片革兰染色
适量BALF标本进行细胞离心，经自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革兰染色。
标本质量判断以扁平鳞状上皮细胞占全部细胞比例＜1%为合格标本。
敏感度为104个细胞/ml，若每个油镜视野可见1个或多个细菌，报告革兰染色形态及白细胞结果，提示此菌与活动性肺炎相关。
直接镜检是诊断念珠菌、霉菌定植最简单和实用的方法
标本的直接显微镜检查：取脓液、痰和局部炎症性分泌物直接涂片，革兰染色后，直接镜检，显微镜下见到革兰阳性（着色不均匀）、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝。
培养结果的报告规范
（1）普通培养：①无菌部位标本培养阴性：多少天？②无菌部位标本培养阳性：多少天？③正常有菌部位标本培养，完全无菌生长；④正常有菌部位标本培养，仅有正常菌群分离；⑤正常有菌部位标本培养，2种或2种可能致病菌，伴或不伴正常菌群分离。
（2）靶向培养，重复分离株，拒收报告，注意事项。
未完待续
来源 重症肺言 重症肺言整理 施毅教授审阅
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