医学笔记|铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊断的进展和困境（上）

多重耐药（MDR）PA导致的下呼吸道感染与更高的病死率有关，早期识别耐药PA对降低病死率、缩短住院时间和医疗费用至关重要。PA耐药机制复杂，主要包括外膜通透性下降，主动外排系统过表达、产生灭活酶、靶位点改变、生物被膜形成等。现有的抗菌药物敏感试验（AST）包括表型AST和基因型AST，前者观察细菌在含药培养基上的生长情况，后者直接检测耐药基因。传统的表型AST主要有肉汤稀释法、K-B纸片扩散法、E-test法等。肉汤稀释法可精确测量最小抑菌浓度（MIC），但操作繁琐。K-B纸片扩散法应用广泛，操作简单，但抑菌圈大小无法精确对应具体MIC数值。E-test法结合稀释法与扩散法，操作便捷且可得出具体MIC数值，但费用较高。联合药敏试验可基于K-B法或肉汤稀释法开展，可观察2种或多种抗菌药物联合使用是否有协同或相加作用，对广泛耐药PA（XDR-PA）感染的治疗具有指导价值。

碳青霉烯类抗生素耐药PA所致感染的抗感染方案的选择困难，因此也最受关注。针对PA产碳青霉烯酶表型或基因型的检测取得进展。目前革兰阴性菌产生的碳青霉烯酶主要为A类丝氨酸酶（如KPC），B类金属酶（如IMP、VIM、NDM），D类丝氨酸酶（如OXA-48、OXA-23）。Carba NP试验是临床广泛使用的碳青霉烯酶检测方法，原理为碳青霉烯酶水解亚胺培南后溶液pH改变而发生颜色变化，其检测产碳青霉烯酶PA的灵敏度和特异度均>90%，但结果受检测溶液pH、培养基类型、接种量、孵育时间等多种因素影响。改良Hodge试验（MHT）原理是通过引入大肠埃希菌作为指示菌，碳青霉烯类抗菌药物被灭活后可观察到指示菌在其抑菌环与试验菌株接种线相交处生长，对Ａ类和D类碳青霉烯酶有较高敏感性。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）采用质谱技术，可通过检测PA特异性蛋白实现菌种鉴定，还可通过检测培养基中碳青霉烯类药物结构的完整性检测PA耐药性，对A类和B类碳青霉烯酶有很高的检测能力，但检测设备昂贵，尚不能大规模用于临床。

以实时荧光定量PCR（qPCR）为基础的检测方法可直接检测耐药基因，也可通过检测不同药物浓度下目的基因扩增推断该抗菌药物浓度是否有效，还可通过逆转录PCR检测不同药物浓度下目的基因转录水平评估细菌的耐药性。qPCR检测速度快，但耐药表型可能涉及多种基因突变及表达，仅检测单一耐药基因可能无法准确预测耐药表型。商业化PCR检测试剂盒Xpert Carba-R检测KPC、NDM、VIM的灵敏度高。商业化微阵列试剂盒（bioFire filmArray，Verigene等）可实现更多耐药基因检测。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）被认为是检测碳青霉烯酶类抗生素耐药相关基因的最全面的分子检测方法，还可绘制横向和纵向的流行和传播图谱，监测PA的流行和爆发三代测序技术，主要包括单分子荧光测序（SMRT）和纳米孔（Nanopore）测序等，无需PCR扩增，通过对DNA/RNA分子单独测序，避免了扩增过程中碱基错配。特别是Nanopore测序，装置便携、测序读长长、检测耗时短，可同时进行菌株鉴定和耐药基因分析，有望广泛用于临床病原诊断和耐药基因的快速检测。

有研究发现一些PA克隆株（如ST235、ST111和ST175）在世界范围内广泛分布，与耐药表型有关，被称为PA高风险克隆株，PA高风险克隆株可在一定程度上代表MDR的存在，多位点序列分析（multi-locus sequence typing，MLST）通过对等位基因进行多样性分析识别高危克隆株，是目前用于检测高风险克隆株的金标准。其他技术如多位点数目可变串联重复序列分析（MLVA）、双位点分型（DLST）也可用于克隆株的识别。我国近期发现的碳青霉烯类抗生素耐药的PA克隆株ST463常携带KPC基因且具有较高毒力，值得引起重视。监测高风险克隆株在特定区域内的流行和传播有利于早期对患者进行针对性的抗菌药物治疗，降低死亡率，同时加快疫苗研发和单克隆抗体制备以应对日益严峻的PA耐药问题。

分子生物学技术的发展帮助我们更高效地检测耐药PA，但对耐药基因的检测结果需谨慎解读，耐药基因阴性并不一定代表对相应抗菌药物敏感，因为还可能存在其他耐药机制；而即使耐药基因阳性也不完全代表相应抗菌药物无效，耐药表型还与耐药基因的表达等因素有关。目前情况下，临床抗菌药物选择仍需结合体外药敏试验进行综合评估。

来源：重症肺言 作者：杨麟 周华