原发性肝癌是中国乃至全世界较为常见的恶性肿瘤，发病率居于世界第七(4.7%)，死亡率位于全世界第三(8.3%)[1]，由于原发性肝癌起病隐匿且早期诊断困难，大多数患者确诊时已经是中晚期，常规治疗手段有限，患者5年生存率较差[1]。近年来，肿瘤免疫治疗凭借其在体内产生的强大且持久的抗肿瘤作用受到广泛关注，其中免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞治疗、肿瘤疫苗等肿瘤免疫疗法逐渐应用于原发性肝癌的临床治疗实践当中。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)T细胞是一种经基因编辑修饰的T淋巴细胞，能够识别肿瘤特异性抗原并活化T淋巴细胞，使T淋巴细胞发挥肿瘤杀伤作用，作为一种过继性免疫细胞疗法，其突出的安全性及有效性已在多种血液肿瘤治疗中展现。截至目前，已有六款自体CAR-T细胞产品获FDA批准上市，其中四款靶向CD19，另有两款靶向BCMA；2021年6月和9月，中国国家药品监督管理局(national medical products administration, NMPA)也先后批准两款靶向CD19的CAR-T细胞产品(复兴凯特，倍诺达)上市，均为血液肿瘤的适应证[2-3]。随着CAR-T细胞疗法在血液肿瘤领域“一次性治愈”式的革新，细胞免疫治疗也激发了业界对CAR-T细胞疗法应用于实体瘤的研究热情。作为发病率和死亡率均居前列的原发性肝癌也成为了关注的焦点，近年来已有多个针对肝细胞癌(HCC)特异性靶点的CAR-T细胞疗法完成早期临床试验，众多新型CAR-T细胞疗法也正在研发，同时CAR-T细胞与其他疗法联合治疗的研究也陆续被推出，成为原发性肝癌免疫治疗研究的新热点；本文将从多角度对CAR-T细胞治疗原发性肝癌临床研究进展进行综述。

1.1   CAR-T细胞结构以及作用机制

CAR-T细胞是由单克隆抗体的单链可变区(single chain antibody fragment, scFv)和T淋巴细胞信号传导区连接而成，针对不同的肿瘤细胞抗原构建不同的单克隆抗体代替T淋巴细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)中的互补决定区，避免主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制性，CAR中svFv通过特异性的识别肿瘤特异性抗原直接将信号传到T淋巴细胞内，使T淋巴细胞活化，分泌细胞因子，杀灭肿瘤细胞[4-5]。与TCR相比，CAR抗体能够识别更广泛的肿瘤细胞抗原，以MHC非限制性方式使T淋巴细胞活化，进而发挥高效性和特异性的抗肿瘤效应。CAR作为CART的核心，其结构主要由胞外区、铰链区、跨膜区和胞内区四部分组成。胞外区通常由针对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen, TAA)的单克隆抗体的轻链及重链连接而成。铰链区需针对不同TAA调整其长度，以便更好发挥靶向结合能力[6]。跨膜区常由CD3、CD8、CD28的跨膜区构建，在T淋巴细胞活化中发挥重要作用。胞内信号区主要由如CD28、CD134、CD137等组成。CAR大体结构由膜外段和膜内段组成，膜外段主要是结合特异性抗原的单克隆抗体可变区，膜内段由刺激结构域和共刺激结构域组成。目标靶抗原的选择是CAR特异性的关键性因素，随着CAR-T细胞的广泛应用，其结构也在不断优化迭代[7]。

1.2   CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的分子机制

T淋巴细胞加入(嵌合)特定抗原的受体，以使T淋巴细胞行使特异的杀伤功能。T淋巴细胞识别肿瘤抗原后，激活T淋巴细胞免疫通路，相关基因表达上调，分泌颗粒酶、穿孔素直接介导肿瘤细胞溶解，同时也分泌细胞因子介导固有免疫系统杀伤肿瘤细胞，一是通过直接靶向杀伤表达特异性抗原的肿瘤细胞, 二是通过诱导自亡杀伤抗原丢失的肿瘤细胞[8]。

1.3   CAR-T细胞发展

1.3.1   第一代

最初版本的CAR设计成只有CD3 TCR或Fc受体(Fc receptor, FcR)的CD3链，与外部scFv相连，给T淋巴细胞一个激活的信号，同时由于这些区域连接简单，缺乏T淋巴细胞活化所必须的第二信号，导致其激活效率较低，不足以产生高效的T淋巴细胞反应或持续的细胞因子。因此第一代CAR-T并未在临床应用中获得预期效果[9]。

1.3.2   第二代

第二代CAR-T细胞在第一代CAR-T细胞的基础上，在胞内段添加了一个来自共刺激分子CD28、OX40或者CD137(4-1BB)的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM) 结构域。这些细胞内信号域的存在在临床前模型中提高了T淋巴细胞的持久性、细胞因子的分泌以及抗肿瘤的功效，胞外的抗原识别区与靶抗原结合后，可使T淋巴细胞同时获得抗体刺激信号及共刺激信号。这使得第二代CAR-T细胞的活化能力远远强于第一代，相关临床试验[5]证实了第二代CAR-T对B细胞急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤患者有很强的抗肿瘤功效。

1.3.3   第三代

第三代CAR主要结构同二代CAR相似，但其使用慢病毒作为转染载体，可携带更大的基因片段进入T淋巴细胞，因此三代CAR-T在其胞内段携带了多个共刺激域，如CD28-41BB或CD28-OX40，来提高CAR-T细胞的杀伤效能，使其产生更多的细胞因子，更强大的抗肿瘤能力，并能够增加T淋巴细胞的增殖。此外，一些第三代CAR的临床前研究报告显示，与第二代CAR相比，第三代CAR在临床上疗效更好、更易增殖，可产生更多的细胞因子。然而，关于第二代及第三代CAR-T细胞疗效问题，目前仍然存在争议[10]。

1.3.4   第四代

第四代CAR-T细胞，也称为精准CAR-T细胞。其结构与前三代不同，引入了促炎症细胞因子和共刺激配体，主要目的是克服抑制性的肿瘤免疫微环境。第四代CAR-T包括自杀基因、整合表达免疫因子、整合共刺激因子配体等精确调控方式的加入，可能有含CD28的3个不同的共同刺激因子加入。第四代CAR-T在胞内区进一步加入自杀基因或促炎细胞因子，以此增强对T淋巴细胞反应调控或通过释放不同的细胞因子来招募其他的免疫细胞至肿瘤部位，产生不依赖于T淋巴细胞的杀伤作用[11]。

1.3.5   第五代

第五代CAR-T细胞即通用型CAR-T，是指从健康志愿者获取T淋巴细胞并进行基因编辑敲除相关基因，然后转入CAR基因制成的CAR-T细胞，最主要的优势在于不需要从患者体内获取T淋巴细胞进行定制，而是可以做到现货供应，从而节约时间和治疗花费[12]。

2.1   CAR-T总体研究现状

截至2023年初，中国登记注册了800余项关于CAR-T细胞的临床研究，其中三分之二在ClinicalTrials.gov登记注册，三分之一在Chinese ClinicalTrial Registry登记注册。2021年开始，中美CAR-T临床试验注册总数出现了下滑，而在前几年一直是增加的态势。在地区分布方面，中国CAR-T细胞治疗临床研究主要分布在北京、江苏、上海、浙江和广东等医疗资源集中、科研水平较高和经济较发达地区。从试验进度来看，CAR-T细胞疗法的临床试验集中处在早期临床和phaseⅠ、PhaseⅠ/Ⅱ，有不到10%的管线处在phaseⅡ以及之后的阶段[2]。

2.2   CAR-T研究适应证

在适应证方面，在2022年正在进行的三百余项临床试验中，血液肿瘤占绝大多数，尤其是B淋巴细胞恶性肿瘤。有23%试验适应证为实体瘤，其中最常见实体瘤包括肝癌、胰腺癌和脑癌。目前已经有部分企业在做肿瘤之外的适应证，并且比例有所增加，疾病涵盖范围较为广泛，包括自身免疫性疾病、传染病等[13]。

具体来说，针对自身免疫性疾病的CAR-T细胞试验包括系统性红斑狼疮、硬皮病、肾炎、干燥综合征、视神经脊髓炎谱系障碍，传染病则包括艾滋病、慢性活动性Epstein-Barr病毒感染和COVID-19[14-16]。虽然国内开展的临床试验项目较多，获批开展临床的CAR-T项目超过了40项，但获NMPA批准上市的只有两款，说明CAR-T研究前景远大，并且仍然需要探索。

3.1   磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3) CAR-T细胞

3.1.1   GPC3生物学原理

GPC3是一个65 kD的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的580个氨基酸的硫酸肝素蛋白多糖，它通过激活Wnt途径在肿瘤发生中起作用，提示预后不良[17]。并且GPC3在非肿瘤组织表达很少。53%的HCC患者中发现可溶性GPC3，可以作为生物标志物，在HCC的发展和预后中均发挥作用。与对照组相比，HCC细胞中的GPC3表达降低导致肿瘤增殖减少，凋亡增加，肿瘤细胞迁移受损。因此GPC3成为肝细胞癌CAR-T细胞治疗的热门靶标。

3.1.2   GPC3靶向CAR-T细胞的临床前研究及临床研究

为了提高GPC3-CART在实体瘤中的功能，Kolluri等[18]在2022年美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上报告了对GPC3进行了VH区域改造，检测了9种结构域，发现工程化的HN3 CAR-T细胞疗法在治疗由Wnt失调引起的侵袭性HCC方面显示出强大的能力。除了针对改造CAR-T细胞已增加侵袭性以外，还可以增加GPC3-CAR-T细胞的增殖以及运送，如增加实体瘤中的IL-2稳定表达，以促进CAR-T细胞增殖以及运送，Aspuria等[19]在2022年构建了一个人类正交(orthogonal)配体/受体系统，包括一个IL-2 (STK-009)和一个突变的IL-2受体β(orthoIL-2Rβ)，动物实验证明上述系统能够增强GPC3的CAR-T细胞的抗肿瘤活性和持久性。在临床研究中，目前报道了两项自体第二代41BBζ GPC3-CART在晚期HCC成人中的连续Ⅰ期试验(NCT 02395250，NCT03146234)。第一项研究在环磷酰胺和基于氟达拉宾药经淋巴排泄后，输注GPC3靶向的CAR-T细胞。共入组13例患者，9例出现细胞因子释放综合征(CRS)，未出现3级或4级神经毒性。3年的总生存率为10.5%，1年为42%，6个月为50.3%。试验中1例患者病情持续稳定，在44.2个月依然生存。此外，临床试验还在研究GPC3 CAR-T与检查点抑制剂的联合治疗，特别是对PD-L1阳性的HCC。这项研究为进一步开发“优化的”GPC3-CAR-T方法提供了基础[20-21]。为此，在GPC3-CAR-T设计上添加结构，包括41BBL和IL-15/IL-21的工程模块(NCT02932956)等，旨在提高GPC3-CAR-T细胞的杀伤能力[22]。

联合治疗也是目前GPC3的研究热点之一。为了防止靶点逃逸，Cao等[23]开发了一种新型的双特异性T淋巴细胞啮合剂CAR-T(CAR.T-BiTEs)，驱动GPC3和BiTE针对CD3和B7H3的特异性CAR的表达，体外功能检测显示，与GPC3 CAR-T细胞(GPC3靶向CAR-T细胞)和B7H3 CAR-T细胞(B7H3靶向CAR-T细胞)相比，GPC3-BiTE CAR-T细胞对GPC3+/B7H3+ HCC细胞系表现出更大的细胞毒性活性。酪氨酸激酶抑制剂或免疫检查点抑制剂的联合治疗方法(NCT03980288)[24]，以及通过肝动脉输注的靶向递送(NCT03993743)都正在研究中[25]。多药联合是未来研究的改进方向。

3.2   甲胎蛋白(AFP) CAR-T细胞

3.2.1   AFP生物学原理

AFP是一种591个氨基酸的糖蛋白，几乎只在胚胎发育过程中表达，以及慢性肝脏炎症和60%~80%的HCC中表达[26]。AFP在细胞内(加工成肽)和细胞表面均表达，同时也在MHC Ⅰ类分子上表达。在生物学上，AFP促进肿瘤增殖，其在体内异常升高的表达水平预示着预后不良。但是由于AFP定位问题，其作为CAR-T细胞治疗靶点设计依然存在一定的难度[27]。

3.2.2   AFP靶向CAR-T细胞临床前研究及临床研究

由于AFP的细胞内定位及其在MHC上的表达，CAR-T细胞设计难度较大。一项研究利用定位系统ET1402L1开发了第二代AFP-CAR-T(CD28/CD3ζ)，这是一种完全人源化的组合，专门针对AFP158-166位点。该CAR-T的缺点是将患者限制在特定的HLA匹配群体中，但却为CAR-T领域提供了针对细胞内抗原的机会。这对于缺乏细胞表面靶点的实体瘤来说至关重要，可以扩大CAR-T的治疗范围[28]。

在临床前模型中，将携带HLA-A HCC SK-HEP-1-MG和HEPG2肿瘤细胞表达AFP158-166表位的免疫缺陷型NSG小鼠进行AFP-CAR-T的瘤内注射，与对照组相比抑制了肿瘤的生长[29]。在临床研究方面，一项针对AFP阳性HCC的Ⅰ期临床试验AFP-CAR-T(NCT03349255)，给药方法为静脉注射和肝内动脉给药治疗，目前已经终止，至今无研究结果报道。但是目前看来AFP靶点依然充满了潜力，只要解决了定位问题，临床前景巨大[30]。

3.3   黏蛋白1(MUC1) CAR-T细胞

3.3.1   MUC1生物学背景

MUC1是一种膜结合的糖基化磷蛋白，其表达由炎症细胞因子诱导。MUC1在HCC中过量表达，并通过免疫组化分析验证为潜在的HCC靶点，70.8%的HCC病例显示MUC1强阳性，并且在正常肝组织中无表达。MUC1与HCC的预后和转移密切相关。67.7%的MUC1阳性患者在3年内发生转移，而无MUC1表达的患者转移率只有31%。因此MUC1是一种很有前景的CART肝癌靶点[31]。

3.3.2   MUC1靶向CAR-T细胞临床前研究及临床研究

在乳腺癌中已经设计出MUC1 CAR-T细胞，名为TAB004(针对糖基化MUC1的mAb)，在异种移植模型中具有靶点特异性的细胞毒性，以及细胞因子的分泌和减少肿瘤负荷。体外研究[32]显示，MUC1对HCC细胞系有特异性的疗效。

在临床研究中一项包括HCC在内的多种实体瘤的MUC1-CAR-T临床试验正在进行(NCT02587689)，但结果尚无报道。一项用于头颈部鳞状细胞癌的第四代MUC1-IL-22分泌型CAR-T产品已立项，目前正在进行中[33]。

3.4   NKG2D配体(NKG2DL)CAR-T细胞

3.4.1   NKG2DL生物学背景

NKG2DL是一种表达在NK和T淋巴细胞上的Ⅱ型跨膜蛋白，在NK细胞的激活和为CD8+与CD4+T淋巴细胞提供共刺激中发挥作用。NKG2DL在HCC中过度表达，突出了其作为免疫治疗靶点的潜力。MICA是靶向NKG2D的特定配体，在大多数正常组织中不表达，并且定位在上皮细胞的细胞质中，为NKG2DL的CAR-T提供了一个潜在的靶点。但是需要警惕肿瘤外NK细胞和T淋巴细胞耗竭，这也是未来研究的方向[34-35]。

3.4.2   NKG2DL靶向的CAR-T细胞临床前研究以及临床研究

第三代NKG2DL-CAR-T的体外实验发现在SMMC-7721和MHCC97H细胞系中存在特异性细胞毒性，细胞毒性具有NKG2DL依赖性。NKG2DL低的MICA和ULBP2细胞不易受影响，但NKG2DL高的HEP3B易受影响[36]。在体内研究中，NKG2DL-CAR-T对接种SMMC-7721皮下肿瘤的NOD-Prkdcscid//Il2rgtm1/Bcgen小鼠(B-NDG)有效。50%(3/6)的治疗小鼠在灌注后19天达到完全缓解(CR)，50%(3/6)达到部分缓解(PR)[36]。已经开展临床研究的NKR-2(NCT02203825)在7例急性骨髓性白血病患者和5例多发性骨髓瘤患者Ⅰ期临床试验报告中没有明显的毒性或其他不良事件[37-38]。完整的临床数据正在等待后续剂量升级。但是到目前为止，尚无HCC的数据。

3.5   其他潜在的用于治疗HCC的CAR-T靶点

除了上述靶点外，还有很多有潜力的靶点可以用于HCC的CAR-T治疗。CD147是一种跨膜糖蛋白，在HCC中高度表达，在增殖、侵袭和转移中发挥作用，是一种潜在的生物标志物。Zhang等[39]开发了一个抗CD147-CAR-T的“tet-on”诱导系统，需要给予多西环素以获得CAR活性。停用多西环素后，体外细胞实验中CD147-HepG2靶细胞杀伤率从50%降至10%。在体内实验中，使用皮下Huh-7 NSG小鼠模型，与单独使用CD147 CAR相比，CD147 CAR联合多西环素治疗后肿瘤体积明显减少。目前，一项Ⅰ期临床试验正在进行中(NCT03993743)[40]。

黑色素瘤抗原基因家族(MAGE)几乎只在癌症组织中表达。在68%的HCC肿瘤中有MAGE-1和-3 mRNA的表达[41]。从功能上讲，MAGE的异常表达可以导致信号的改变和肿瘤的发生。但是到目前为止，MAGE-CAR-T在HCC中的证据有限。纽约食管鳞状细胞1(NY-ESO-1)，一种癌症-睾丸抗原(CTA)，常见于多种侵袭性肿瘤中的癌症相关蛋白，它在包括乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、NSCLC、肝细胞癌以及卵巢癌在内的多种癌症中广泛表达，表达范围为20%~80%，是全身最具免疫原性的抗原之一，因此，被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。目前，只有针对NY-ESO-1的工程TCR-T方法在HCC中进行了试验(NCT01967823)[43]。

4.1   与溶瘤病毒的联合治疗

溶瘤病毒是一种抗肿瘤药物，具有裂解性和免疫原性，可以选择性地感染和杀死肿瘤细胞。在FDA批准Talimogene laherparepvec (T-VEC)之后，溶瘤病毒疗法在癌症治疗中受到广泛关注。溶瘤病毒可以通过基因工程在肿瘤微环境中表达许多转基因，增强肿瘤特异性T淋巴细胞的效应活性，对实体恶性肿瘤，溶瘤病毒具有与CAR-T细胞协同作用的特殊能力。有1项获批的临床研究(NCT03740256)[44]验证了CAR-T和溶瘤病毒联合治疗HER2阳性恶性肿瘤的情况。此外，预测结合两种强效促炎症免疫疗法的安全性也很困难。虽然T-VEC的临床前价值已经确认，但联合溶瘤病毒可能会增加CAR-T细胞副作用的严重程度。因此，需要谨慎考虑安全剂量。

4.2   与免疫检查点抑制剂联合使用

目前CAR-T细胞治疗实体瘤的问题之一就是存在免疫抑制性肿瘤微环境。多种因素参与了这种免疫抑制性微环境的发展，包括抑制性分子，如PD-1、CTLA-4、LAG-3等。研究表明，免疫检查点抑制剂联合CAR-T细胞治疗可以极大地提高CAR-T细胞疗效。这些抗体可以预防T淋巴细胞的耗竭，保持其效应功能。免疫检查点抑制剂与CAR-T细胞联合治疗的多项研究已经开启(NCT01454596, NCT03030001, NCT02873390, NCT03179007, NCT02862028, NCT03182803)[45]。Li等[46]在2023年建立了针对GPC3和阻碍PD-1/PD-L1结合的双目标CAR-T细胞，新构建的双靶点CAR-T细胞在HCC中表现出比其他常见的单靶点对应细胞更强的肿瘤抑制作用，这提示了在HCC治疗中加强CAR-T细胞活性的潜力。

CAR-T细胞疗法在实体瘤中的应用仍面临着诸多挑战，诸如靶点逃避、靶向非肿瘤效应、CAR-T细胞扩增、肿瘤内浸润受限以及免疫抑制微环境等因素，限制了CAR-T细胞在实体肿瘤中的研发进程。

5.1   靶点逃逸

靶点逃逸是最具挑战性的难点。虽然单一抗原靶向的CAR-T细胞具有较高的应答率，但使用这些CAR-T细胞治疗的大部分患者肿瘤细胞会出现目标抗原表达的部分或完全丧失，导致耐药，即为靶点逃避效应[47]。

当前针对CAR-T细胞在实体瘤治疗中所产生的靶点逃避效应，解决策略聚焦于靶向多种抗原：即使用双CAR结构或串联CAR结构，这是一种包含两个或更多单链抗体的单CAR结构，能够同时靶向多个肿瘤抗原。研究[48]报道与单靶点CAR-T细胞治疗相比，串联HER2和IL13Ra2 CAR结构在胶质母细胞瘤中产生了更好的抗肿瘤反应，提示优化靶抗原选择的重要性。然而目前针对肝内胆管癌相关CAR-T细胞治疗的研究极少，相关CAR-T细胞治疗的改进策略有待新的探索和临床验证。

5.2   剂量影响因素

对肝癌患者使用多大CAR-T细胞剂量一直存在争议，其机制主要为低剂量可能加速T淋巴细胞耗竭，而高剂量又会增加毒性，并且剂量对疗效也有很大影响。

为了解决剂量与疗效的关系，一项研究在恶性黑色素瘤CAR-T治疗进行了机器学习预测剂量对T淋巴细胞群动态的影响。发现最低剂量(5 000万个细胞)不能减少肿瘤，并导致T淋巴细胞耗竭加速。在肿瘤负荷比不足的情况下，由于低剂量或扩张能力，输注的CAR-T细胞将在起效之前耗尽。1.5亿~4.5亿个细胞剂量下T淋巴细胞耗竭减缓，并且具有细胞杀伤效应，因此，疗效与剂量有关。推测剂量影响因素可能是由患者的免疫状态预先决定的[49]。

5.3   CAR-T细胞运送和持久性因素

加强CAR-T的运送和进入HCC肿瘤部位是目前亟待解决的问题。CAR-T细胞治疗在HCC存在物理屏障，HCC普遍具有纤维化细胞外基质(ECM)，而CAR-T细胞缺乏肝素酶，无法穿过ECM[50]。

为了解决这项问题，部分研究正在探究可降解ECM的CAR-T细胞是否在HCC治疗中具有运送优势。趋化因子也是CAR-T细胞运送作用的一个重要影响因素，其在白细胞迁移/归宿和癌症迁移/进展中起着关键作用。在CAR-T产品中设计表达趋化因子受体，可以利用肿瘤相关的趋化因子梯度来增强CART的肿瘤运送。CXCL2在HCC中高表达，在HCC模型中，GPC3-CAR-T细胞上过表达CXCR2L受体(CXCR2)可以增强CAR-T在肿瘤部位的浸润和扩增[17]。

5.4   CAR-T免疫抑制肿瘤微环境因素

实体瘤内存在免疫抑制信号，也是CAR-T细胞治疗所面临的困境，如何克服免疫抑制微环境也是CAR-T目前研究的关键点。研究[51]发现，CAR-T衍生的细胞因子可以激活宿主的巨噬细胞，并将肿瘤微环境从免疫抑制性转变为免疫刺激性。在卵巢癌中，分泌IFN-γ和GM-CSF的CAR-T细胞可以激活肿瘤相关巨噬细胞，减少调节因子的表达，并增加IL-12的产生，促进内源性免疫并抑制肿瘤生长[52]。免疫检查点抑制剂作为一种潜在的组合方法，可能与CAR-T细胞同时发挥作用。具有内置检查点阻断功能的CAR-T工程可以提供一种“一体化”战略，例如PD-1缺陷的GPC3-CART[46, 53]。