2019年8月26日，上海市胸科医院陆舜课题组、美国系统生物学研究院魏巍课题组和复旦大学生物医学研究院/附属闵行医院施奇惠课题组合作在《自然通讯》（Nat Commun）杂志上发表了题为“Liquid Biopsy-Based Single-Cell Metabolic Phenotyping of Lung Cancer Patients for Informative Diagnostics”的文章，该研究发展了一种基于液体活检的肿瘤单细胞代谢分型的方法，能够预测对靶向治疗或化疗无效或只能短期获益的患者。这一工具在传统的基因分型之外给临床医生提供了新的与代谢功能相关的信息，帮助医生更准确的诊断与选择药物，同时可为患者减少无效的治疗，节约宝贵的时间以尝试其他更有前途的治疗方法。该论文的第一作者为上海市胸科医院的李子明博士，共同第一作者为复旦大学生物医学研究院的王卓博士和美国系统生物学研究院的汤寅博士。 

临床现状

        肺癌是我国发病率与死亡率第一的恶性肿瘤，而大部分患者在发现是已是晚期。目前对晚期非小细胞肺癌的治疗策略是基于基因分型，根据患者是否具有药物敏感的驱动突变（如EGFR, ALK, ROS1等）给予相应的靶向药物治疗或化疗。但即使如此，临床上也能观察到具有相同驱动突变特征的患者在接受相同的治疗时产生不同的响应，如20%-30%具有EGFR敏感突变的非小细胞肺癌患者对EGFR TKI药物原发耐药或只能短暂获益，而其他患者却能获益较长时间。对于靶向治疗，目前尚没有简单有效的方法能够在治疗前或治疗过程中患者仍然获益的时候提前准确预测临床获益程度。类似的，对不具有敏感突变患者进行的化疗，患者的临床响应也有较大的差异，但目前也没有简单有效的方法预测其临床响应。

假说背景

        肿瘤具有异常的能量代谢调控机制以满足其生长需求，这是大多数种类肿瘤的共同特征。已有的研究表明，肿瘤代谢具有很大的可塑性和异质性，且与药物响应和耐药相关。本研究在单细胞尺度上分析肺癌患者胸腔积液样本中游离肿瘤细胞的能量代谢特征，并通过代谢分型将其与患者对治疗的响应与生存期相联系。其中，单细胞的分辨率比以往的群体细胞分析（如组织）能可更清晰的解析肿瘤细胞的代谢特征，而液体活检样本中的游离肿瘤细胞使我们无需对样本进行复杂处理（如将组织消化成单细胞）就能快速、高通量的进行单细胞代谢分析。同时，液体活检也能使我们更方便地，用损伤更小的方式获得肿瘤细胞样本。

科学假设

        基因分型是精准医学的主要基础，但是在相同的驱动基因突变背景下，不同的细胞是否具有不同的能量代谢特征？且这种代谢上的差异是否对相同治疗方案的响应程度是否一致？ 

研究方法与结果

       本研究对32名肺腺癌患者的胸腔积液进行了研究，发现胸腔积液中的肿瘤细胞的能量代谢具有很大的异质性，而高代谢活性的肿瘤细胞主要采取糖酵解和线粒体氧化两种不同的表型。

       我们进一步发现，有EGFR基因突变的患者，其两种代谢表型的细胞数目的比值可用于预测患者对治疗的响应与生存期，明显高糖酵解的患者预后不佳。进一步的转录组分析显示糖酵解表型的肿瘤细胞具有间质细胞的特征且高表达受体酪氨酸激酶AXL和免疫检查点配体。

       本研究揭示了肺腺癌患者在相同的驱动突变背景下仍然具有不同的能量代谢特征，且这种代谢上的差异可导致对相同治疗方案的不同响应。因此，本研究发展的单细胞代谢功能检测工具可患者进行进一步的细分，以更好的用药。 

研究背后的故事

       恶性肿瘤在播散、侵袭、转移的过程中常伴有肿瘤细胞进入体液，如血液、胸腹水、脑脊液等。因此，在这些体液样本中找到肿瘤细胞是判定肿瘤存在、甚至转移的可视化高级别证据，具有明确的临床意义。但是，这些体液样本中包含多种细胞且肿瘤细胞的数目常常较少，给临床检测带来挑战。以往在体液样本中鉴定脱落肿瘤细胞主要依赖于细胞学检查，基于肿瘤细胞的形态学特征进行鉴定，并进一步结合免疫组化明确其器官来源和病理分型，费时费力且有较高的专业要求。

       如何在传统的形态学检查之外探索快速、简便的稀有恶性细胞鉴定新方法？美国麻省理工学院的Robert A. Weinberg教授在2011年总结了肿瘤细胞的十大基本特征（"Hallmarks of Cancer: The Next Generation",Cell, 2011, 144, 646），包括维持增殖信号，逃避生长抑制，抑制细胞死亡，无限自我复制，诱导血管生成，激活浸润转移，避免免疫损伤，促进肿瘤炎症，能量代谢异常以及基因组不稳定等。这些基本特征能够有效地鉴别恶性细胞，但其中除了能量代谢异常外，其他特征均难以方便地在单细胞尺度上进行鉴定。肿瘤细胞具有不同于正常细胞的能量代谢途径，这一现象首先被Otto Warburg观察到。即使在氧气存在的情况下，肿瘤细胞仍主要以糖酵解的方式进行能量代谢，其摄取的葡萄糖大大高于正常细胞，这一效应被称为Warburg效应，Warburg也因此获得1931年的诺贝尔奖。Warburg效应在临床上已有广泛应用，通过将带有放射性标记的葡萄糖类似物（18F- FDG）作为示踪剂，应用正电子发射断层摄影术（PET/CT）可以非侵袭性、可视化灵敏检测体内高葡萄糖摄取的恶性组织，从而发现肿瘤原位及转移病灶。由于放射性标记的葡萄糖类似物的空间分辨率较低，该研究采用荧光标记的葡萄糖类似物在体外对大量细胞的葡萄糖摄取能力进行高通量检测。其基本假设是在胸水样本中高葡萄糖摄取且不表达白细胞共同抗原（CD45）的细胞有较大可能是肿瘤细胞，具有这类细胞的胸水可被鉴定为恶性胸水。

       我们的课题组提出：是否可以通过肿瘤细胞的能量代谢异常这一基本特征在体液样本中高通量、快速鉴定肿瘤细胞，并通过大量的单细胞测序确认其可靠性？经过将近一年多的研究，研究结果于2017年发表于美国科学院院报（PNAS）的"High-throughput screening of rare metabolically active tumor cells in pleural effusion and peripheral blood of lung cancer patients" (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2017,114, 2544-2549)，该研究中提出可通过荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG在肺癌患者的胸腔积液和血液样本中检测循环肿瘤细胞，并通过单细胞测序加以验证。该论文发表后被Faculty of 1000 Prime推荐。

       基于2017年PNAS文章的结果充分说明了在胸水样本中检测高代谢活性的细胞是一种快速鉴定恶性胸水的有效方法，有望成为现有细胞学检查的有益补充。该方法筛选到的高代谢活性细胞均具有高度活性，因此能方便地进行单细胞测序与体外培养。进一步的实验表明，该方法可被应用于血液样本中循环肿瘤细胞的检测，但由于血液中的细胞数目远多于胸水，检测时间也需相应延长。

        2019年发表的这篇文章是在PNAS文章的基础上，进一步的延续。我们提出了使用两种不同的代谢标记物的方法，最大可能的找到循环肿瘤细胞，并且发现了不同代谢细胞的临床意义的差异，为将来临床的运用提供的坚实的基础。

作者 | 李子明 陆舜（上海胸科医院）

编辑 | 郝冉（中国医学论坛报）